組織や細胞に含まれるタンパク質を包括的に調べるプロテオミクスは、生命現象を総合的に理解するだけでなく、疾患の予測に重要なバイオマーカーの探索にも用いられています。しかしながら、解析に使用する試料が微量な場合、複数の工程からなる前処理の段階でタンパク質やペプチドを損失してしまうことが問題となっています。本研究では、前処理に用いられる様々な界面活性剤を比較した結果、界面活性剤LMNG^*の存在下でタンパク質の酵素消化と脱塩を行うことで、微量試料中のタンパク質、ペプチドの損失を大幅に抑えられることが示されました（LASP法）。

本研究で開発したLASP法は、プロテオミクスの様々な解析方法に応用することができます。具体的には、シングルセル解析において、LMNGを含まない一般的なプロテオミクスの方法で処理した場合のタンパク質検出数が50種類程度でしたが、本法によって平均で1100種類程度のタンパク質を検出することが可能となりました。したがって、本法は疾患などにかかわるタンパク質候補の検出や細胞でのタンパク質の機能の情報を従来法以上に高感度で取得できることが期待されます。

研究成果は、2024年3月4日に国際学術雑誌「Molecular and Cellular Proteomics」に公開されました。
本研究の成果は特許申請中です。

^*界面活性剤LMNG；ラウリルマルトースネオペンチルグリコール

論文タイトル：Universal pretreatment development for low-input proteomics using lauryl maltose neopentyl glycol
著者：Ryo Konno, Masaki Ishikawa, Daisuke Nakajima, Yusuke Endo, Osamu Ohara, and Yusuke Kawashima
掲載誌：Molecular and Cellular Proteomics
doi: 10.1016/j.mcpro.2024.100745

＜詳細＞
タンパク質を網羅的に分析するプロテオームでは①タンパク質抽出、②還元-アルキル化、③酵素消化、④逆相固相抽出カラムを使用した脱塩、⑤乾燥、そして⑥再溶解のステップで前処理が行われ、酵素消化されたペプチドを質量分析計で分析します。
しかし、微量試料では前処理③でタンパク質およびペプチドが損失する影響を大きく受けてしまいます。この問題を改善するために界面活性剤を用いた方法や、微量試料に特化した手法も開発されていますが、界面活性剤の除去が困難であることや特殊な機器が必要であることが課題となっています。
そこで本研究では前処理④の固相に強く吸着する界面活性剤を模索し、吸着度合いの違いにより、酵素消化ペプチドから界面活性剤を簡便に除去する方法の開発に着手しました。その結果、界面活性剤を容易に除去することができ、タンパク質、ペプチドの損失を抑えた方法LASP法の開発に成功し、微量試料であるシングルセルプロテオミクス(SCP)へ適応させました。

12種類の界面活性剤を用いて前処理④の固相により強く吸着する界面活性剤の探索を行った結果、界面活性剤LMNGを見出しました。LMNGが混在した状態で酵素消化することでタンパク質、ペプチドの損失を抑制できるLMNG-assisted sample preparation (LASP) methodを開発しました。このLASP法を免疫沈降法やリン酸化濃縮法などに応用した結果、通常よりも多くのタンパク質を検出することに成功しました。
また、SCPにもLASP法を適応したscpLASP法を開発し、微量試料に対してどれくらい有用であるかを確認しました。LMNGを含まない一般的なプロテオミクスの方法で処理したシングルセルのタンパク質検出数は50タンパク質程度に対して、scpLASP法では平均で1100タンパク質程度を検出しました。したがって我々の開発したLASP法やscpLASP法は特殊な機器を必要とせずに微量試料に致命的なタンパク質、ペプチドの損失を改善することが示されました。

LASP法はプロテオミクスでは免疫沈降法や修飾解析など様々な方法に応用することができます。また、特殊な機器が必要なSCPへ応用したscpLASP法も開発しており、タンパク質、ペプチドの損失に気を使う必要がなく簡便に分析することができます。このようにLASP法の開発でタンパク質の損失が改善したことによって、従来以上に疾患や分子メカニズムに関連するタンパク質候補の検出や細胞でのタンパク質機能の情報を取得できると期待しています。

図：LASP法の手順。酵素消化液にLMNGを添加したのち、逆相固相抽出カラムに通してLMNGを取り除くことができます。