１）　ターゲットmRNA（標識するmRNA）の精製方法に関して

　total-RNA、poly(A)-RNA、どちらを用いるのがいいのか？

アレイに供するRNAは、total-RNAをそのまま使う場合と、poly(A)RNAに精製して使う場合がある。前者は、サンプル時の植物体により近いmRNA集団を反映する。しかし、植物サンプルの場合は、夾雑物により逆転写酵素の活性が抑制されて、十分にラベリングされない可能性があるので注意が必要だ。poly(A)-RNAを用いたほうが無難だろう。

　精製の方法

　実験の反復と後にノーザン解析を行うことを考え、total-RNA100μg以上、poly(A)RNA2μg以上が得られるように計画する。
　これまでに、使用したことのある方法・キットを挙げる。
・total-RNA　超遠心法、RNeasy(QIAGEN)、MagExtractor-RNA(TOYOBO)
・poly(A)RNA　　Oligo-dT30-super(TAKARA)、Micro-FastTrack（invitrogen）

　mRNAのクオリティー

精製したmRNAの質（純度、長さなど）は、標識とハイブリに影響すると考えられる。現状では品質のチェックは難しく、比較するサンプルはできるだけ同条件で精製する。

2)　ターゲットの標識

　標識法

　放射性同位元素33Ｐは測定範囲は広く、32Ｐ、 35Ｓよりも、きれいなシグナルイメージが得られる（Fig.6、98KB）。非放射性では、ケミルミでの測定が可能である。マイクロアレイで使われるCy3/Cy5はバックグラウンドとなるために使用できない。最近、近赤外波長域を２色で検出する標識方法が開発されてきている。この場合は、専用のスキャナーOdyssey(LI-COR)が必要である。

　ターゲットに用いるmRNA量

　mRNA量は、フィルターあたり100ng〜500ngが適する。100ngではシグナルが弱い場合がある。

　cDNA合成とラベリング

　oligo-dT-primerで逆転写を行う際に、dNTPのうちのdCTPの部分をα33P-dCTPに置き換えてラベルする。また、cDNA合成を無標識で行った後にランダムラベルする方法があるが、前者の方が安定した結果が得られている。逆転写される長さは、他の逆転写効率をみた実験から、3kbぐらいは逆転写されているようである。

3)　ハイブリダイゼーション

　用語の定義

　サザン、ノーザン解析は液側が既知でプローブというのに対し、アレイでは、液側 の標識する未知のRNAをターゲット、フィルターに固定した既知のDNAをプローブとい うことが多い。

　ハイブリダイゼーション

　常法に準ずる。アレイでは、ターゲットのmRNAの混合した集団に対して数千のプローブとなるcDNA（フィルター側）とのハイブリダイゼーションとなるので、似た配列があれば、クロスハイブリを生ずることになる。予め高めの温度65℃でハイブリすることで相同的な遺伝子同士の非特異的な結合を減らせると考えられる。

　非特異的な結合を減らすためにpoly-dAを添加する。

　ハイブリ後のフィルターの洗浄

　最終的に63〜65℃で0.1×SSC液で洗浄を行う。ヘテロガスなプローブを用いる場合（シロイヌナズナ以外の植物mRNAを用いる場合）は、私たちは Stringencyを　下げて、55℃-0.5×SSCで洗浄している。　　　　

　シグナルの取り込み

　洗浄後は、フィルターは乾燥させずに、気泡が入らないようにラップをし、暗黒下でイメージングプレート（ＩＰ）に当てる。気泡が入ると、ぼやけたイメージとなることがある(Fig.7､66KB)。

33Ｐは飛程距離が短いので、カセットに入れる際に厚紙を入れて、密着性を高める。取り込み時間は20〜24時間程度が目安である。３日間ではシグナルは濃くなるが、バックグラウンドは上昇し、データの再現性ではそれほど変わらない。

　イメージの数値化

　IPのイメージの取り込みには数種の機械が使われている。STORM(Silicon Genetics社)は50μmの解像度があり、精度の高いデータを得ることができる。

現在のスポッティングでは100μm以上の解像度があればいいので、BAS2000(富士フィルム社)も使用できる。

取り込んだイメージ画像から、各スポットの値を定量するためには専用のソフトを 使用する。ArrayVisionはスポットを自動検出するアライメント機能において優れて おり、使いやすい（Fig.8､41KB）。
 

4)　データの解析

　補正の方法

次の3つがある。マクロアレイは再現性は高いことから、総発現量で補正する場合が多い。
• 総発現量補正　フィルターの総発現量は変わらないと考え、各遺伝子の総和や中央値で補正する。
• 内部基準補正　いかなる条件でも安定して発現するいくつかのクローンの値で補正する。
• 外部基準補正　ESTとハイブリしないRNAのcDNAをスポットし、標識前のターゲットRNAにそのRNAを一定量混ぜて、その値で補正する。

　どの程度が有意な差か？

どの程度で差があるとみなすかは現段階では明らかではない。同じサンプルで、同じ逆転写反応で、同じバックでハイブリさせた場合でも発現の強弱に関わらず、クローンの1％程度は3倍以上の差があり、5倍以上のものもある。仮に、実験誤差で1%の確率で３倍の差があるクローンがあったとしても、実験を２回行えば、確率は0.01%となり、全13542クローンの1〜2クローンに相当する。１つの目安として、実験は２回は行った上で、「差が３倍以上で、２回の傾向が一致している」のであれば、十分に差があるとみてよいと考えている。この場合、フィルター上のDNA量の違いの影響もあるので、リプローブでは対照区と処理区のフィルターを必ず変えて使用する。さらに、その候補クローンは必ずノーザン解析で発現を確認する。

　プロファイリング

　プロファイリングはアレイ解析において重要である。膨大な遺伝子をプロファイリングするためには、専用のソフトが必要である。我々はGeneSpring（Silicon Genetics社）を使っている。GeneSpringは同じ発現パターンをもつ遺伝子をクラスタリングし、既知のゲノム配列情報との関連づけが可能となっている。

5)その他

　フィルターの再ハイブリ

マクロアレイフィルターはリプローブによる再利用が可能である。同一サンプルで３回までは高い再現性があることは確認している。しかし、リプローブしたものとしないものを比べると、再現性は高くない（Fig.9、42KB）ので、同じ回数・同じ条件でリプローブしたもの同士で実験に用いた方がよい。